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熒光素鉀鹽在應用中常見的問題解析

 更新時間:2020-04-07 點擊量:1237
  熒光素鉀鹽是熒光素酶的水溶性底物,存在于多種發(fā)光生物體中。在ATP和熒光素酶的催化作用下,D-熒光素鉀被氧化,產生藍綠色的光(560nm),當?shù)孜镞^量時,產生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關。編碼熒光素酶的Luc基因是植物、**、哺乳動物細胞的常用報告基因。由于沒有背景干擾,因此可以很容易地檢測出低至0.02 pg 水平的熒光素酶。
 
  熒光素鉀鹽可使luc標記基因和熒光素酶融合蛋白在活細胞、組織和生物體的表達成像,廣泛應用于報告基因的分析和衛(wèi)生監(jiān)控。
 
  熒光素適合做哪些實驗?
 
  熒光素鉀鹽和5-氟-熒光素,作為Luciferase的作用底物,常用于以下實驗:
 
  1. 報告基因分析
 
  2. In vivo imaging (動物活體成像)
 
  3. In vitro imaging (細胞體外分析)
 
  4. ATP測定
 
  5. 其它luciferase及其基因相關的分析和研究工作
 
  2、熒光素應用于活體成像的基本原理
 
  細胞中D-熒光素酶參與的化學發(fā)光反應遵守酶促反應的基本原理,在底物D-熒光素鉀過量的情況下,反應產生的光子數(shù)(發(fā)光量)與細胞中的D-熒光素酶的量成正相關,從而可以推算出細胞的數(shù)量。
 
  3、熒光素鉀鹽溶液的穩(wěn)定性
 
  熒光素鉀鹽易溶于水和緩沖液,溶解度可高達25mg/mL。一般使用濃度為3-15 mg/mL。
 
  溶液的pH值、溶液中的氧氣和保存時間對其保存過程中的穩(wěn)定性非常重要。當溶液的pH<6.5(發(fā)生水解作用)或>7.5(發(fā)生消旋化作用,D型轉化為L型)的情況下,D-熒光素鉀鹽相對不穩(wěn)定。如果溶液中存在少量的氧氣,將加速D-熒光素鉀的降解速度。
 
  D-熒光素配成溶液后,在保存條件(-80°C,pH,無氧氣)下,存在固定的降解速度:0.2%/天,因此配成溶液保存的D-熒光素應盡量在1年內使用完。
 
  有水存在的情況下,主要發(fā)生消旋化作用,即D-熒光素轉化成L-熒光素,有報道稱L-熒光素對熒光素酶催化的酶促反應有抑制作用。
 
  4、熒光素、熒光素鈉和D-熒光素鉀之間的區(qū)別
 
  主要區(qū)別在于溶解和分散性能。D-熒光素鉀鹽在水和緩沖液中的溶解度高,且溶解速度較快,故在一般的生物學試驗中常用D-熒光素鉀鹽。
 
  5、D-熒光素鉀鹽的保存和運輸條件
 
  保存條件:≤-20°C,避光,保持干燥。(在不打開包裝的條件下,可保存兩年時間)。
 
  運輸條件:高純度的D-熒光素鉀鹽可在短時間內常溫條件下保存,運輸條件為常溫。
 
  原裝(沒有打開包裝)熒光素的包裝瓶中充有氬氣,保證其穩(wěn)定性,打開包裝后,請嚴格按照保存條件保存。
 
  熒光素鉀鹽具有易溶于水的特性,其暴露于空氣中,易吸潮。在稱量過程中,請考慮其易吸潮的特性,*行溫度平衡,再快速稱取
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